基于受激拉曼散射顯微鏡的高靈敏度無標(biāo)記生物醫(yī)學(xué)成像技術(shù)背景：因為各種化學(xué)鍵有其特征頻率，使得基于紅外吸收和拉曼散射的振動顯微術(shù)可被用作為無標(biāo)記對比度機(jī)制。然而使用長波長的紅外顯微鏡的分辨率不夠，使用短激發(fā)波長的自發(fā)拉曼散射顯微鏡盡管有高分辨率，但是其靈敏度不夠，成像速度不足。相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering,CARS)顯微鏡的靈敏度要高于自發(fā)拉曼散射顯微鏡，但是因為非共振背景的存在，限制了其探測靈敏度。受激拉曼散射(stimulated raman scattering,SRS)于1968年初次觀測到，隨后在許多光譜研究中得到廣 ...

。反斯托克斯拉曼散射不存在熒光問題，因為與激發(fā)波長相比，反斯托克斯拉曼散射是藍(lán)移的，因此在光譜中與熒光自然分離。當(dāng)用可見光激發(fā)時，熒光本底問題更為嚴(yán)重。拉曼光譜中的強(qiáng)熒光信號直接影響拉曼測量的準(zhǔn)確性和靈敏度。熒光和自發(fā)拉曼信號在波長維度上重疊，因此不能用簡單的濾光片分離。幸運的是，它們在以下性質(zhì)上有所不同，這是許多拉曼測量中熒光抑制方法的基礎(chǔ)：1.熒光發(fā)射壽命(納秒量級)遠(yuǎn)長于拉曼散射壽命(皮秒量級)。這一原理產(chǎn)生了各種時域方法，其中一個超快脈沖激光器用于激勵，可應(yīng)用于時域拉曼光譜系統(tǒng)，需要注意的是，激光脈沖不應(yīng)該太短，因為小于1ps的脈沖不太單色，這會導(dǎo)致光譜分辨率的嚴(yán)重?fù)p失。超快光脈沖序列 ...

光脈沖、發(fā)射拉曼散射信號和發(fā)射熒光的時間輪廓。熒光過程包括激發(fā)、內(nèi)部轉(zhuǎn)換和發(fā)射三個重要步驟，每個步驟都發(fā)生在不同的時間尺度上。首先，入射光子激發(fā)熒光團(tuán)分子的時間為飛秒(10-15秒)量級。其次，振動弛豫的無輻射內(nèi)轉(zhuǎn)換過程也非常快，在10-14 ~ 10-11 s之間。最后，熒光發(fā)射是一個緩慢的過程，大約發(fā)生在10-9-10-7 s左右。熒光壽命是指分子在發(fā)射熒光光子前處于激發(fā)態(tài)的平均時間。圖1所示的指數(shù)衰減曲線說明了熒光發(fā)射時間的統(tǒng)計分布。單熒光團(tuán)的熒光時間輪廓符合壽命常數(shù)τ的指數(shù)函數(shù)，而拉曼發(fā)射幾乎與激發(fā)激光同時發(fā)生。由于拉曼信號比熒光信號的發(fā)射速度快得多，因此選擇合適的時間門寬度，原則上可 ...

和反斯托克斯拉曼散射），拉曼散射光強(qiáng)度大約是總散射光強(qiáng)度的10-7 。正是這些波長改變了的拉曼散射光能夠給我們提供有關(guān)樣品的化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)信息.來自分子的散射光有幾種成分：瑞利散射、斯托克斯和反斯托克斯拉曼散射.在分子體系中，這些頻率主要是位于分子轉(zhuǎn)動、振動以及電子能級躍遷相關(guān)的范圍內(nèi)。散射光沿著所有方向輻射，伴隨波長的變化，其偏振方向也有變化。1. 散射光頻率不發(fā)生改變的散射過程稱為瑞利散射，就是Lord Rayleigh用來解釋天空之所以呈現(xiàn)為藍(lán)色的那種過程。2. 散射光頻率（波長）發(fā)生改變的散射過程稱為拉曼散射，拉曼光子的能量與入射光子能量相比可以增大，也可以變小， 取決于分子的振動態(tài)。 ...

正常范圍內(nèi)的拉曼散射本質(zhì)上是非相干的。但通過適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)(稱為q開關(guān))，紅寶石激光器的發(fā)射可以在一個短的持續(xù)時間內(nèi)(10-8秒的量級)和高的峰值功率(高達(dá)100兆瓦或更多)的單個“巨型脈沖”中獲得。當(dāng)如此強(qiáng)烈的相干光照射到樣品上時，就會觀察到全新的現(xiàn)象。正常拉曼效應(yīng)的量子力學(xué)理論變得不充分。受激拉曼效應(yīng)做同調(diào)拉曼散射時，試樣同時受兩雷射之照射，一作激發(fā)用(ωL)，一作監(jiān)控用(ωS)，而拉曼散射之強(qiáng)弱可用ωS之增益為測度。這些現(xiàn)象通常被稱為受激拉曼效應(yīng)。在頻率vo的大脈沖激勵下，樣品在一定的Stokes頻率vo - v時產(chǎn)生增益，其中v是拉曼主動振動的頻率。通常只有一個這樣的頻率是“活躍的”，即每 ...

干反斯托克斯拉曼散射顯微鏡已成為一種強(qiáng)大的技術(shù)，具有許多在生物醫(yī)學(xué)成像、細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。如果泵浦源和斯托克斯場，分別以頻率ωp和ωs與拉曼活性分子相互作用,以并且頻率Ω=ωp-ωs發(fā)生共振，產(chǎn)生頻率為ωAS=2ωp-ωs的諧振反斯托克斯信號。這個信號允許對未染色樣品進(jìn)行化學(xué)選擇性成像。然而，這個信號也有不包含任何特定的化學(xué)信息的非共振信號的貢獻(xiàn)。這種非共振背景強(qiáng)度取決于采樣，非共振信號會使共振信號失真，甚至可以淹沒諧振信號 。共振和非共振CARS響應(yīng)起源于來自三階磁化率。在外向方向上檢測 CARS信號顯著降低了非共振型號的貢獻(xiàn)，因此提高了檢測靈敏度。盡管如此，許多可以避免或消除CA ...

的斯托克斯-拉曼散射光子。拉曼光譜的校準(zhǔn)是通過使用汞氖 (Hg-Ne) 校準(zhǔn)源實現(xiàn)的。我們間隔不同培養(yǎng)時間分別從患癌組織和正常組織選取個別點獲取拉曼信號。圖1正常組織（a）和患癌組織（b）隨培養(yǎng)時間變化的拉曼光譜 如上圖顯示了大鼠正常 (圖 1.a) 和患癌 (圖 1.b) 組織的拉曼光譜變化。值得注意的是，患癌組織的拉曼光譜的變化比正常乳房的拉曼光譜的變化要顯著得多。例如，721 - 828 cm-1 的峰值在患癌組織中比正常組織增加更多。在該區(qū)域，存在被報道為乳腺癌或乳腺癌相關(guān)峰的727cm-1（C-C拉伸）、780cm-1（核苷酸）、811cm-1（核苷酸）、817cm-1（C-C拉伸 ...

聯(lián)照明的相干拉曼散射顯微鏡,可以打破散粒噪聲限制，提高信噪比、靈敏度和成像速度。在對細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行成像時，信噪比提高了 35%。結(jié)合亞波長分辨率和高靈敏度(提升14%)，可以看到原本會被散粒噪聲掩埋的生物特征。利用量子關(guān)聯(lián)可以避免光致?lián)p傷。消除了相干拉曼顯微鏡和更廣泛的高性能顯微鏡進(jìn)一步發(fā)展的根本障礙。原理解析：（1）借助壓縮態(tài)光場的光學(xué)測量可以突破散粒噪聲極限，通過明亮壓縮光源與相干拉曼顯微鏡結(jié)合，可以實現(xiàn)突破散粒噪聲限制的成像效果。顯微鏡采取倒置結(jié)構(gòu)，集成了傳統(tǒng)明場成像和量子增強(qiáng)受激拉曼成像(如圖1a)。選用近紅外波長減小生物樣品的激光吸收和光損傷。圖1a左為泵浦光生成部分，中為受激拉曼散射 ...

光子是由稱為拉曼散射的非彈性散射過程產(chǎn)生的。雖然與瑞利散射光子相比，光子的數(shù)量相對較少，但這些光子的波長和強(qiáng)度攜帶有關(guān)特定化學(xué)鍵存在的定性和定量信息。在給定的拉曼光譜中，出現(xiàn)在特定波數(shù)位置的一組峰可以被描述為識別特定化學(xué)物質(zhì)的“指紋”，同時，峰的高度可以與這種化學(xué)物質(zhì)的濃度有關(guān)。多組分分析是拉曼光譜的應(yīng)用之一。在過去的二十年里，許多研究小組提出了光學(xué)拉曼裝置，專門設(shè)計來提高該技術(shù)測量多組分濃度的能力。這些系統(tǒng)是專門設(shè)計的，以減少整體方法的錯誤，這反過來允許增加所調(diào)查的混合物中分析物的數(shù)量，以及降低可測量的特定化學(xué)品的濃度限制。圖1在這類的第1個實驗中，使用如上圖1所示的基本拉曼設(shè)置來定量水溶液 ...

系統(tǒng)在典型的拉曼散射中，一束光被聚焦到樣品中。散射信號隨后由聚光鏡收集入分光儀，不同波長的拉曼峰被分光儀內(nèi)的光柵在空間上分隔開。在時域中這些峰通常被認(rèn)為是同時到達(dá)光譜儀。這種方法中拉曼信號通常被熒光輻射污染。通過對發(fā)射信號進(jìn)行時間門控，可以將拉曼信號從熒光背景中分離出來:如果短脈沖光激發(fā)分子，拉曼信號在脈沖的脈寬范圍內(nèi)發(fā)射，而熒光的壽命更長。根據(jù)這個想法可得到無熒光的拉曼光譜。但是儀器變得更復(fù)雜，且由于通過門控系統(tǒng)和光譜儀不可避免的損耗，信號的幅值顯著降低。此外通過光學(xué)元件，特別是光譜儀光柵的傳輸通常是偏振相關(guān)的。新的拉曼信號的采集和分析方法解決了這兩個障礙:相對較弱的信號水平和不消失的熒光背 ...